Technique :Immunofluorescence

Technique : immunofluorescence


Exemple : anticorps marqué à la fluorescéine

Les colorants fluorescents en vert les plus connus sont des dérivés
de la fluorescéine comme le FITC (Fluoresceine Iso
Thio Cyanate).

Technique :Immunofluorescence  dans Dossiers Formule_FITC

Principe général de l’immunofluorescence
:

anticorpF dans Dossiers

  • 1-Si l’on veut détecter une substance
    X non soluble (donc fixée) dans la cellule, on l’utilise
    comme un antigène en l’injectant à un lapin. Celui
    réagit en fabriquant des anticorps (immunoglobulines) anti-X.
  • 2-Sur la préparation cellulaire,
    les anticorps anti-X se fixent spécifiquement sur X.
  • 3-On pourrait fixer une molécule
    de fluorescéine directement sur ces anticorps mais il est
    plus aisé d’utiliser des anticorps de chèvre anti-immunoglobulines
    de lapin soudés à une molécule de fluorescéine.
  • 4-Sur la préparation cellulaire,
    les anticorps de chèvre anti-immunoglobulines de lapin
    se fixent spécifiquement sur les anticorps de lapin anti-X.
  • 5-Observée en lumière ultraviolette,
    la fluorescéine fixée fluoresce en vert et permet
    de localiser la substance X.
  • Remarque : de nombreux tests sont nécessaires
    pour éliminer toute fixation non spécifique.

Un fluorochrome est caractérisé par deux spectres : son
spectre d’absorption (de la lumière incidente) et son spectre
d’émission de fluorescence.

spectreF

Comme on le voit, la fluorescéine
absorbe les radiations /bleues (max 490nm) et restitue une fluorescence
verte (max 520nm).

filtre-blocF

blocF4

Le microscope doit être
équipé d’un jeu de filtres correspondant aux caractéristiques
du fluorochrome :

  • 1-un filtre d’excitation permettant la sélection
    des radiation absorbées par le fluorochrome (autour de
    490nm),
  • 2-un miroir dichroïque réfléchissant
    les radiations absorbables vers l’échantillon et ne laissant
    passer par transmission que les radiations vertes et au dessus
    (>500nm),
  • 3-un filtre d’émission ne laissant
    passer par transmission que les radiations vertes et au dessus
    (>500nm).

Optique simplifiée
du microscope à fluorescence

  • 1-lampe à arc
  • 2-filtre d’excitation
  • 3-miroir dichroïque
  • 4-objectif
  • 5-préparation
  • 6-filtre d’émission
  • 7-oculaire

Voici en vue moins schématique les
résultats d’une expérience :

la substance choisie correspond à la tubuline des microtubules
dont on veut connaître la localisation au cours de la mitose.
L’anticorps primaire utilisé est un anticorps anti-tubuline.
L’anticorps secondaire est marqué par de la fluorescéine
(FITC). L’observation est réalisée sur des cellules PTK
en culture (culture obtenue à partir de cellules de rein de rat
kangourou : « Potorous tridactilus Kidney »).

microNB

microR

microF

Observation témoin
classique en lumière blanche.

Observation en utilisant
le jeu de filtres spécifique de la rhodamine.

Observation
en utilisant le jeu de fitres spécifique de la fluorescéine.

fluo-nb

imageN

-fluofluo

Résultat : seule une bonne adéquation
entre le type de jeu de filtres utilisé et le fluorochrome employé
permet des résultats probants : ici, le fuseau et les asters
sont mis en évidence.

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